Produksi Hormon Pertumbuhan Manusia (human Growth Hormone/hGH) sebagai Protein Farmasetik atau Pharmaceutical Products Menggunakan Teknologi DNA Rekombinan pada Escherichia coli untuk Pasien Dwarfisme Hipofisis

Hormon pertumbuhan diproduksi oleh kelenjar hipofisis. Hormon ini mengatur pertumbuhan dan perkembangan. Hormon pertumbuhan merangsang pertumbuhan tubuh secara keseluruhan dengan meningkatkan serapan seluler asam amino, dan sintesis protein, dan mempromosikan penggunaan lemak sebagai bahan bakar tubuh.

Hormon pertumbuhan manusia (human Growth Hormone/hGH) yang tidak mencukupi pada anak-anak muda menghasilkan pertumbuhan yang terbelakang, secara klinis disebut sebagai dwarfisme hipofisis. Tinggi anak biasanya kurang dari empat kaki, dan memiliki wajah gemuk dan lemak berlimpah di pinggang.

Hormon pertumbuhan, somatostatin, sangat sulit diisolasi dari binatang; diperlukan setengah juta otak domba untuk diekstraksi menjadi 0,005 g somatostatin murni. Dengan mengkloning gen manusia untuk somatostin pada bakteri, jumlah hormon yang sama ini dapat diproduksi dari 9 L fermentasi bakteri transgenik. Satu dari 5000 anak menderita dwarfisme hipopituitari akibat defisiensi hormon pertumbuhan dan kemudahan ketersediaan biofarmasi ini akan memiliki manfaat luar biasa untuk penderita anak-anak ini.

Traditional treatment untuk dwarfisme:

Anak-anak dari dwarfisme hipofisis dirawat dengan suntikan hormon pertumbuhan yang diekstraksi dari otak manusia yang telah meninggal. Dapat dicatat bahwa hanya hormon pertumbuhan manusia yang efektif untuk pengobatan kekerdilan. (Ini berbeda dengan diabetes dimana insulin hewan dipergunakan).

Setidaknya delapan kelenjar hipofisis dari mayat harus diekstraksi untuk mendapatkan hGH yang memadai untuk merawat anak kerdil hanya untuk satu tahun. Dan perawatan seperti itu harus dilanjutkan selama 8-10 tahun. Lebih lanjut, pemberian hGH yang diisolasi dari otak manusia membuat anak-anak berisiko besar menularkan penyakit dari otak mayat (melalui virus atau agen yang menyerupai virus) misalnya Creuzfeldt-Jacob (CJ) syndrome ditandai oleh kejang-kejang, gangguan otot dll.

Produksi hGH rekombinan:

Ahli bioteknologi sekarang dapat menghasilkan hGH dengan rekayasa genetika. Teknik yang diadopsi cukup sebanding dengan produksi insulin. Prosedur ini pada dasarnya terdiri dari memasukkan gen hGH ke dalam plasmid Escherichia coli, membiakkan sel-sel dan mengisolasi hGH dari media ekstraseluler.

Batasan dalam produksi hGH:

HGH adalah protein yang terdiri dari 191 asam amino. Selama sintesis alami dalam tubuh, hGH ditandai dengan peptida tunggal (dengan 26 asam amino). Sinyal peptida dihilangkan selama sekresi untuk melepaskan hGH aktif untuk fungsi biologis. Seluruh proses sintesis hGH berlangsung secara teratur di dalam tubuh.

Namun, sinyal peptida mengganggu produksi hGH dengan teknologi rekombinan. DNA komplementer (cDNA) yang disintesis dari mRNA mengkode hGH untuk dimasukkan ke dalam plasmid. Plasmid yang mengandung Escherichia coli saat dikultur menghasilkan hGH panjang bersama dengan sinyal peptida. Tetapi Escherichia coli tidak dapat menghilangkan sinyal peptida.

Selanjutnya, juga cukup sulit untuk menghilangkan sinyal peptida dengan berbagai cara lain. Secara teoritis, sinyal peptida mengkode cDNA agar dapat dipotong untuk menyelesaikan masalah ini. Sayangnya, tidak ada batasan endonuklease untuk melakukan pekerjaan ini, maka ini tidak mungkin.

Pendekatan baru untuk produksi hGH:

Ahli bioteknologi telah menyelesaikan masalah interupsi sinyal peptida dengan pendekatan baru (Gbr. 15.2). Urutan basa dalam cDNA mengkode sinyal peptida (26 asam amino) ditambah 24 asam amino tetangga (misal total 50 asam amino) dipotong oleh restriksi endonuklease ECoRI.

Sekarang sebuah gen (cDNA) untuk 24 urutan asam amino hGH (yang telah dihapus) baru disintesis dan diikat ke cDNA hGH yang tersisa. cDNA yang terbentuk, dilekatkan pada vektor, dimasukkan ke dalam bakteri seperti Escherichia coli untuk kultur dan produksi hGH. Dengan cara ini, hGH yang berfungsi secara biologis dapat diproduksi oleh teknologi DNA. Rekombinan hGH disetujui untuk digunakan manusia pada tahun 1985. Dipasarkan sebagai Protropin oleh Genetech Company dan Humatrope oleh Eri Lilly Company.

Produksi Hormon Pertumbuhan Manusia Rekombinan:

Mature hGH telah diproduksi dalam bakteri Escherichia coli menggunakan teknologi DNA rekombinan menggunakan skema yang diuraikan pada Gambar 1. Proses ini melibatkan kloning cDNA ke mRNA hGH hipofisis dan adaptasi selanjutnya yaitu dari gen hasil kloning ekspresi didalam E. coli. hGH, karena disintesis di hipofisis, dibuat sebagai prehormon yang mengandung peptida hydrophobic leader dari sekitar 20 asam amino dalam panjangnya. Peptida hydrophobic leader ini secara proteolitik dihilangkan oleh hipofisis selama sekresi hGH. Namun, sebagian besar E. coli tidak memiliki alat biokimia untuk melakukan pemrosesan yang sama secara efisien, dengan demikian 84 pasangan basa DNA beruntai ganda disintesis untuk menyesuaikan hGH cDNA untuk diekspresikan secara langsung. Proses ini melibatkan pengikatan fragmen pembatasan dari pengkodean cDNA untuk asam amino 24 sampai 191 dari hormon pertumbuhan ke urutan sintetis yang dikodekan untuk kodon awal (misalnya ametionin) dan 23 asam amino pertama dari GH. Dengan demikian, molekul disintesis dalam E. coli  yang mengandung 191 asam amino dari GH mature dan satu tambahan asam amino, suatu metionin terminal amino, dari kodon awal.

Gambar 1. Cloning messenger hormon pertumbuhan manusia (hGH). Ukuran messenger RNA difraksinasi yang diisolasi dari hipofisis manusia disalin menggunakan reverse transcriptase untuk membentuk heteroduplex molekul. Untai RNA kemudian dipindahkan dengan untai DNA kedua dengan DNA polimerase I Fragmen Klenow. Campuran yang dihasilkan dari molekul DNA untai ganda dipotong dengan restriksi oleh endonuklease Hae III dan difraksinasi pada gel elektroforesis agarosa. Khusus hGH cDNA dari 551 pasangan basa (base pair) panjangnya "berekor" dengan deoxycytosine menggunakan deoxynucleotide terminal transferase dan diikat ke dalam vektor kloning ekor dG menggunakan DNA ligase. Campuran dari ligated plasmids digunakan untuk mengubah E. coli. Klon yang mengandung fragmen cDNA hGH diisolasi dan fragmen 551-bp yang diamplifikasi dimurnikan.

Mekanisme kerja:

Secara umum, mekanisme kerja recombinant growth hormone (rGH) dapat secara langsung maupun tidak langsung. Secara langsung, rGH menginduksi diferensiasi sel-sel prekursor terkait fungsi fisiologi (metabolisme lemak, karbohidrat, suplay nitrogen pada organisme masa pertumbuhan) tanpa perantara IGF-1 (Insulin Like Growth Factor-1) dalam hati atau langsung ke organ target. Mekanisme secara tidak langsung adalah pertumbuhan dimediasi atau melibatkan IGF-1 dalam hati. Di dalam hati rGH diubah menjadi IGF-1. IGF-1 juga dikenal dengan somatomedin C yang banyak dihasilkan oleh hati dengan rangsangan hormon pertumbuhan yang dihasilkan oleh kelenjar pituitari. Produksi hormon ini mempunyai peranan yang sangat penting dalam tubuh. IGF-1 yang diproduksi oleh hati berfungsi untuk meningkatkan pertumbuhan jaringan. IGF-1 termasuk kedalam kelompok zat-zat yang dikenal sebagai faktor-faktor pertumbuhan bersama unsur-unsur pertumbuhan epidermal (kulit), transformasi (pertukaran), pembentukan platelet (darah), fibroblas (otot), syaraf, serta faktor pertumbuhan siliary neurotropik (sel). IGF-1 adalah hormon yang disekresikan oleh hati akibat adanya hormon pertumbuhan (Yamaguchi dkk, 2006).

Kontroversi penggunaan hGH:

Rekombinan hGH dapat diberikan kepada anak-anak dengan perawakan sangat pendek. Itu harus diberikan setiap hari selama bertahun-tahun dengan biaya tahunan sekitar $ 20.000. Beberapa pekerja telah melaporkan peningkatan substansial dalam ketinggian pertumbuhan anak-anak terbelakang.

Satu kelompok pekerja mengamati bahwa pola pertumbuhan normal pada anak-anak tidak dipulihkan pada pemberian hGH, meskipun ada percepatan awal. Pertanyaan besar lain yang diajukan oleh penentang terapi hGH adalah apakah perlu untuk mempertimbangkan perawakan pendek sebagai gangguan untuk perawatan.

Penggunaan hormon pertumbuhan rekombinan untuk hewan ternak:

GH rekombinan sekarang tersedia untuk administrasi pada hewan ternak untuk mendorong pertumbuhan dan perkembangan awal. Hewan ternak tersebut menghasilkan daging linier, di samping peningkatan produksi susu. Namun, penggunaan GH pada hewan ternak adalah masalah kontroversial.